Komórki macierzyste w regeneracji narządowej, ze szczególnym uwzględnieniem regeneracji pozawałowego mięśnia sercowego - wykład plenarny
prof. dr hab. Maciej Kurpisz
prof. dr hab. Maciej Kurpisz
Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu
Istnieje szereg postaw etycznych, reprezentowanych przez poszczególne społeczności naszego globu, wobec aplikacji tzw. totipotencjalnych komórek macierzystych (w tym pojęciu mieszczą się pierwotne komórki zarodkowe) w medycynie. Najbardziej liberalne okazują się być w tym względzie państwa azjatyckie (Singapur, Korea Płd, Chiny). Komórki pluripotencjalne (somatyczne) oraz komórki rezerwuarów tkankowych (tzw. committed progenitor cells) są znacznie łatwiej w tym względzie akceptowane. Istnieją podstawowe definicje (różnicowanie, transróżnicowanie, transdeterminacja, odróżnicowanie, fuzja), które opisują podstawowe kierunki zmian charakteru komórek macierzystych (genotypowo i fenotypowo). Utrzymuje się, że u gryzoni transróżnicowanie (zmiany fenotypowe nie pociągające za sobą podziału komórkowego) jest możliwe, natomiast u człowieka należy do procesów wyjątkowych. Rezerwuar tkankowy stanowi u człowieka pulę komórek samoodnawialnych w każdym organie – klasyfikuje się narządy/tkanki jako o odnowie szybkiej (jelita, chrząstka, kości, włosy, skóra) lub wolnej (ośrodkowy układ nerwowy, trzustka, serce). Ten ostatni narząd regeneruje się w proporcji 1% komórek rocznie. Komórki macierzyste namnażają się w tzw. niszach, a ich proces samoodnowy w zasadzie jest regulowany przez ten sam system sygnałowy we wszystkich przypadkach – tj. w wyniku wzrastającego gradientu b kateniny (w jądrze komórkowym) wskutek działania pozytywnie działającej osi Wnt oraz negatywnego sprzężenia układu Bmp (regulowanego przez czynniki Noggin i Notch). Komórki macierzyste mogą w swoim procesie samoodnawialności (rozrostu) mutować powodując niekontrolowany rozrost nowotworowy, zawarty w niszy, bądź niezależnie od niej (przerzutowanie, mutacje macierzystej komórki rodzicielskiej). W mięśniu sercowym, tzw. komórki CPC (cardiac progenitor cells) znajdują się w niszach w obrębie przedsionka oraz w pobliżu koniuszka. Komórki CPC o markerze Isl1, są szczególnie obiecujące w dalszych badaniach nad samoodnową mięśnia sercowego.
Naszym obiektem badawczym są mioblasty, czyli zaktywowane komórki satelitowe, leżące na powierzchni włókna mięśniowego. W wyniku urazu, komórki te aktywują się (wzrasta ekspresja czynników transkrypcyjnych Myf5 i MyoD), zaś mioblasty namnażają się i przechodzą proces różnicowania w miotubule (miogenina), których dalsza fuzja powoduje wytworzenie nowego włókna mięśniowego (czynnik Mrf4). W badaniach nad rolą mioblastów w regeneracji pozawałowego mięśnia sercowego przeprowadziliśmy dwie próby klinicznej fazy I/II , gromadząc do każdej z nich po 10 pacjentów Pierwsza próba kliniczna polegała na podaniu mioblastów bezpośrednio do miokardium przy okazji zabiegu pomostowania aortalno-wieńcowego (tzw. ‘by-pass’ lub CABG), na otwartym sercu – mioblasty implantowano w okolicę blizny pozawałowej. W tych badaniach uzyskano poprawę frakcji wyrzutowej serca (EF – ejection fraction), podstawowego parametru hemodynamicznego serca, u wszystkich pacjentów, jednak nie można było stwierdzić, jaki w tym wpływ miał sam zabieg wytworzenia krążenia obocznego, a w jakim procencie poprawę stanu spowodowało podanie mioblastów. Stwierdzono też bezpieczeństwo samego zabiegu wraz z implantacją komórek, pomimo faktu, że powodowały one przejściowe zaburzenia rytmu, pochodzenia komorowego. W drugiej serii badań klinicznych zdecydowano się podać same mioblasty, aby potwierdzić wyłączny efekt komórek macierzystych na poprawę funkcji mięśnia sercowego (10 pacjentów). Wykonano pionierskie w świecie podanie przezskórne, przy pomocy systemu cewników z wewnętrzną głowicą ultradźwiękową i również zaobserwowano przyrost frakcji EF, jednak nie u wszystkich pacjentów, a jedynie u tych, którym przetoczono najwyższe liczby komórek (>250x106). Ze względu na zaburzenia we współpracy pomiędzy zaimplantowanymi, autologicznymi komórkami macierzystymi a kardiomiocytami chorego narządu, które asocjowane są z niską ekspresją genów dla konneksyny i N-kadheryny (w implantowanych mioblastach), utworzyliśmy model, w którym mioblasty transfekowane są przejściowo sekwencjami pro-angiogennymi i cytoprotekcyjnymi, tak aby polepszyć przeżywalność mioblastów w miokardium jak i maksymalnie zachować ich funkcję kurczliwą przez dodatkowe unaczynienie. Badania funkcjonalne trwają z wykorzystaniem immunotolerancyjnych myszy SCID, u których indukowany jest zawał serca, a następnie przeprowadzana jest terapia genetycznie modyfikowanymi mioblastami człowieka.
Somatic stem cells in organ regeneration – a model of post-infarction heart
Maciej Kurpisz
Institute of Human Genetics, Polish Academy of Sciences, Poznan
Numerous controversies exist among different ethnic societies inhabiting our globe concerning the application of totipotential stem cells (embryonal stem cells) in medicine. The most liberal societies seem to lie outside of Europe and America (Singapore, South Korea, China, Israel). Pluripotential, somatic stem cells as well as stem cells of tissue reservoir (committed progenitor stem cells) are much easier to be accepted for cell engineering. There is a bunch of basic definitions (differentiation, transdifferentiation, transdetermination, dedifferentiation, fusion) which describe a way of behavior of the stem cells as well as their phenotypic and genotypic features. It is maintained that that in rodents the process of transdifferentiation (differentiated phenotype often without cell division) may occur, however in human primates is rather exceptional. A tissue reservoir constitutes the cells with ability of self renewal in each organ/tissue. As such we may classify the high turnover organs (intestinum, skin, bone, cartilage, hair) or organs with a low turnover (central nervous system, pancreas, heart). The last one regenerates itself in proportion of 1% of cells per year. Stem cells multiply in a quite complex process that takes place in specialized niches. Regulation seems to be quite universal for all organs – signaling between cytoplasmic and nuclear b catenin is of principal value. Positive control is exerted by canonical ax of Wnt while the negative regulation by Bmp which is secreted due to oscillating levels of Noggin set up by Notch. Somatic stem cells during their self renewal can be mutated to the uncontrolled malignant growth which may be contained within a niche, it could be also independent from the niche (metastases, mutation of parental stem cells). In myocardium were recently discovered so called CPC (cardiac progenitor cells) which are also contained in the niches on the border of ventricles and close to the apex. CPC’s express marker Isl1 and are considered as one of the most promising target for cell regeneration of myocardium.
In our studies, we explored a model of myoblasts, i.e. activated satellite cells that are located on the surface of myofiber. At the time of muscle injury, these cell are activated, undergoing the changes supervised by transcription factors (Myf5, MyoD) when myoblasts multiply and transform into myotube by myogenin and then as the muscle fiber (Mrf4). We have performed two clinical trials of I/II phase studying the role of myoblasts in regeneration of post-infarction heart. Each trial contained 10 patients. The first attempt included delivery of autologous myoblasts directly to myocardium at the opportunity of ‘bypass surgery’ (CABG) on the open heart. Myoblasts were then implanted to post-infarction scar. We have obtained the improvement of basic hemodynamic heart parameter, which is ejection fraction (EF) in the all studied patients, however, it was impossible to say which factor was primarily responsible for the observed improvement – CABG or myoblast delivery, and in which proportion? We have emphasized however, feasibility and safety of myoblast intervention despite of the fact of that they caused episodes of ventricular arrhythmia. In the second series of clinical trails we decided to deliver the myoblasts alone in order to check the sole effect of the myogenic stem cells (10 patients). We pioneered a percutaneous approach through the coronary vein with catheter system including internal ultrasound – and we have observed as well a significant improvement of EF, however, only in these patients who have received high doses (>250x106 of cells). Due to the disclosed limited co-operation between the implanted stem cells and cardiomyocytes of infarcted heart (what has been associated with a low expression of connexin and N-cadherin in myoblasts) we have created a new model of human myoblasts that have been transfected with pro-angiogenic and cytoprotective gene sequences. Such genetically modified human myoblasts are now studied in the immunocompromise SCID mice in which previously a heart infarction was induced.